消泡劑在生物發酵行業的應用

作者:admin 發布日期: 2020-05-28 二維碼分享
上文我們已經簡單介紹了消泡劑的一些基本知識,大家應該已經知道了什么是消泡劑,消泡劑的消泡機理,那么針對不同的行業怎樣選擇合適的消泡劑呢?
下面讓我們一同進入生物發酵行業,來打開消泡劑在這個行業中應用!
消泡劑因其使用方便,成本低廉,能耗少而在發酵工業中得到廣泛應用。每種消泡劑都具有一定的消泡效果,但也都有可能對培養環境以及細胞生長產生有利或有害的影響,進而影響目的產物的合成。因此,在選用消泡劑時要綜合考慮其種類、功能、添加濃度及其對發酵過程產生的影響,以達到.佳的效果。 
消泡劑也稱消沫劑,是在食品加工過程中降低表面張力,抑制泡沫產生或消除已產生泡沫的食品添加劑。我國許可使用的消泡劑有乳化硅油、高碳醇脂肪酸酯復合物、聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚、聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚、聚氧丙烯甘油醚和聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚、聚二甲基硅氧烷等7種。目前,消泡劑被廣泛應用于醫藥行業及調味品、乳制品、豆制品、飲料、制糖業、酶制劑等食品工業;然而,消泡劑的添加往往根據經驗確定,很少有理論或數據來支撐。
泡沫可定義為液體介質中穩定的氣體,是一種氣體在液體中的分散體系,氣體成為許多氣泡被連續相的液體分隔開來,氣體是分散相,液體是分散介質。目前,在單克隆抗體、重組蛋白、抗生素、酶制劑、有機酸、燃料乙醇等的發酵生產過程中,由于通氣、攪拌、培養基中糖和蛋白質的存在、細胞及代謝產物的積累等原因必然產生大量的泡沫。這些泡沫的存在對微生物培養過程、菌體收集、產物分離等工序都會產生影響。大量持久的泡沫如不能及時消泡,會造成罐內供氧量不足,尾氣過濾器堵塞,罐壓升高,菌體生長和產物合成抑制,甚至會發生逃夜現象,降低發酵設備裝料系數和利用率,增加染菌風險。若不能很好地解決泡沫問題,將會對發酵工業造成巨大影響。那么怎樣防止泡沫的形成呢?方法有兩種:一種是機械消泡,一種是化學消泡——添加消泡劑。由于機械消泡效果欠佳、易受環境制約、投資大,目前已少有廠家使用。消泡劑具有消泡速度快,效果明顯等優點,廣泛用于發酵工業中。國內外有關消泡劑使用的文獻較多,已有研究表明消泡劑會導致流體動力學特性和傳質性能的降低,對細胞生長速率,細胞形態和產物合成產生影響,這些影響可能有利于可溶性蛋白質的表達系統,如增加α-淀粉酶和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的分泌,或通過生物量增加而實現更高的蛋白產量。然而,在某些情況下,消泡劑可能對細胞和蛋白質表達產生不利影響,并且這種影響根據所表達的蛋白質不同而變化。目前的研究都是片段化的,還沒有學者對消泡劑在發酵過程中的應用進行系統的研究與總結。
消泡劑的性能主要體現在消除已產生的泡沫和抑制泡沫形成兩方面。目前對于消泡劑的性能評價還沒有統一的標準,主要是在實驗中相互比較來評判。消泡劑性能測試的方法主要有循環鼓泡法、振蕩法、羅斯-邁爾斯法、高速攪拌法、泵循環噴射法。這些方法都是利用泡沫體積的變化來比較消泡劑的消泡性能,只是消泡劑的加入時機有所不同。國內生物發酵行業主要采用循環鼓泡法來測試消泡劑的性能。
消泡劑性能測試結果受到測試方法、測試液、測試體積、消泡劑種類、消泡劑濃度及添加量等多種因素的影響,不同的測試環境中可能會得到不同的結論,因此無法宏觀的去比較消泡劑性能,必須根據具體實驗條件選擇合適的測試方法,以獲得.佳結果。
消泡劑對原核生物發酵的影響
魏浩等研究發現,聚醚類消泡劑能顯著促進植物內生菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2的生長,發酵24 h時菌體干質量為對照(未添加消泡劑)的21.4倍,而豆油能夠促進抗菌肽的合成,其表面活性肽(surfactin)和(fengycin)的含量分別是對照的24.61倍和13.29倍。崔耀軍通過小試和工業化批次生產實驗發現發酵專用消泡劑LB-625對菌體基本無影響,跟敵泡和有機硅消泡劑相比,對中溫α-淀粉酶酶活力有一定提高。ANDERSSONE等考查不同濃度的PEG3350和PEG600對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacil-lus amyloliquefaciens)合成α-淀粉酶的影響。研究發現在添加8%PEG600及5%PEG3350條件下,枯草芽孢桿菌合成的α-淀粉酶增加1倍,而添加9%PEG3350抑制α-淀粉酶合成,此外,添加20%PEG600能夠促進枯草芽孢桿菌合成α-淀粉酶,但抑制解淀粉芽孢桿菌對α-淀粉酶的合成。進一步研究發現細胞形態在雙水相體系發生變化,PEG可能與細胞壁相互作用,使枯草芽孢桿菌細胞變得更親水,解淀粉芽孢桿菌細胞變得更加疏水。PEG對兩種芽孢桿菌影響差異可能是由于對細胞壁或膜的作用造成。RAO J L U M等[36]研究了不同分子質量的PEG對地熱芽孢桿菌分泌α-淀粉酶的影響。研究發現0.5%分子質量>4 000 Da的PEG導致α-淀粉酶比活降低,效價增加;而較低分子量的PEG導致α-淀粉酶比活增加,效價降低。當PEG濃度>0.5%時,α-淀粉酶的產量下降。作者認為α-淀粉酶效價的增加可能是由于生物體膜磷脂的改變,提高了酶的分泌。KOCH V等研究發現,S184(硅油),SLM54474(聚丙二醇(poly propylene glycol,PPG)),VP1133(硅油/PPG混合物)對菌體生長(菌體濃度、比生長速率、葡萄糖消耗)及產物合成沒有顯著影響;而SE9(10%S184)能夠顯著促進大腸桿菌(Escherichia coli)K12的生長及產物合成,其菌體濃度是其他消泡劑的2倍左右。SLM54474、S184、VP1133、對產物活性也有一定的影響,隨著SLM54474 及VP1133濃度的增加而β-半乳糖苷酶活性逐漸增加,隨著S184濃度的增加而β-半乳糖苷酶活性逐漸降低。劉躍等研究發現,在發酵培養基中0.10%的磷酸三丁酯和0.06%THIX-298 聚醚改性硅油能顯著提高埃博霉素A/B(分別提高 31.41%/18.05%和48.12%/ 48.55%),其他消泡劑對菌體和產量影響較小。為了探究消泡劑對纖維堆囊菌生長和埃博霉素產量提高的原因,作者對發酵過程中的pH、還原糖、氨基酸態氮,α-酮戊二酸脫氫酶復合體(oxog-lutarate dehydrogenase complex,OGDHC)酶活進行檢測,發現THIX-298聚醚改性硅油能夠促進菌體對氨基氮和還原糖的利用,pH環境變化也較為緩和,從而使菌體量增加,相應的埃博霉素產量也得到提高,說明THIX-298聚醚改性硅油提高埃博霉素的原因與提高菌體量有關。
消泡劑對真核生物發酵的影響
馬曉梅等在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基中分別加入0.1%、0.4%、0.7%(V/V)的10種消泡劑,考察消泡劑對棘孢木霉菌株Tr148c生長的影響,結果發現天然油(豆油)、聚醚類(GPE-6330,GP-6301)和有機硅類(L-101a、L-104a)對Tr148c的菌絲生長抑制作用顯著弱于其他消泡劑(P<0.05)。在 10 L發酵罐中進行108 h的發酵驗證,L-101a的產孢量(2.25×108個/mL)顯著高于L-104a(1.45×108個/mL)和GPE-6330(1.65×108個/mL)(P<0.05)。HOLMES W等[38]研究發現,釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母在搖瓶培養基中表達重組Fc融合蛋白都受到消泡劑類型、濃度以及所用培養基的的影響,巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的生物量隨著J673A消泡劑濃度(0~8%)(V/V)的增加而增加;釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生物量隨著SB2121消泡劑濃度(0~8%)(V/V)的增加而降低;8%的消泡劑C對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生長沒有影響。雖然高濃度的消泡劑能夠促進細胞生長,濃度>1%的消泡劑就會引起重組蛋白質表達量下降。覃先武等研究消泡劑對面包酵母發酵產量和酵母活力的影響中也有類似發現,J763消泡劑對酵母生長基本沒有影響,獲得的干酵母活力達到730 mLCO2/h,而GPE5005、PPG2000及二甲基硅油對酵母生長的抑制作用逐漸增加,獲得的干酵母活力也逐漸降低。MUKAIYAMA H等研究發現,0.1% 的 PEG8000 能夠改善人轉鐵蛋白(human transferrin,HTF)的分泌,而1%的PEG8000對細胞生長有抑制作用。hTF分泌增加是由于PEG改變了細胞的磷脂組成。ROUTLEDGE S J等研究了5種消泡劑對巴斯德畢赤酵母生產重組綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的影響。發現添加0~1%)(V/V)的消泡劑A、消泡劑C、J673A、P2000、SB2121會增加重組GFP的表達量,P2000、SB2121和J673A促使GFP表達量幾乎增加1倍。然而只有消泡劑A,消泡劑C和J673A組的GFP的單位菌體產率增加,這表明由于添加P2000和SB2121組GFP總產量的增加可能是因為細胞的生長特征的改變。添加0.8%消泡劑C組在對數期的比生長速率.慢,而J673A、P2000和SB2121組生長速率較高。作者采用碘化丙錠排除和流式細胞術測量,發現消泡劑不影響細胞的活力及培養基中的溶解氧濃度。通過比較流式細胞術檢測細胞中保留的GFP與熒光測定法在培養基中保留的GFP,發現消泡劑A,消泡劑C或J673A是通過增加分泌到培養基中的比例來增加GFP的特定產率。隨后,該學者又將GFP研究中篩選出的.佳消泡劑濃度應用于人腺2a受體(human adenosine 2a receptor,hA2aR)的表達研究,發現該濃度的消泡劑雖然有利于GFP的表達,但是對hA2aR的表達產生不利影響,目的蛋白產率低于對照組[3]。
消泡劑對哺乳動物細胞發酵的影響
VELUGULA-YELLELA S R等研究了非有機硅類(消泡劑204)和有機硅消泡劑(消泡劑C,SE-15,Y-30和EX-Cell)在ProCHO 5,PowerCHO 2和EX-Cell Advanced三種培養基中對CHO DG44細胞生長和嵌合 IgG1抗體產量的影響。研究發現消泡劑204和Y-30對細胞有毒性并抑制細胞生長,含Y-30消泡劑的Power-CHO 2培養基中細胞能存活,但活細胞密度積分(integral of viable cell density,IVCD)和比生產率顯著低于消泡劑C(P<0.05),EX-Cell和SE-15組。消泡劑C,EX-Cell和SE-15的IVCD為15~35×106個細胞(/mL?d),比生產率為1.5~2.3 pg/(mL?d)。消泡劑C在ProCHO 5和 PowerCHO 2培養基中具有較高的滴度,而EX-Cell消泡劑在EX-Cell Advanced培養基中具有較高的滴度。除了PowerCHO 2培養基中,消泡劑C在ProCHO 5和EX-Cell Advanced培養基中具有較高的比生產率。
消泡劑可以影響細菌、酵母和CHO細胞的生長以及產物合成,提高培養物的生長速率可提高產量。ROUTLEDGE S J等[18]研究發現,0.6%消泡劑A,1%J673A,1%P2000和1%SB2121組的比生長速率生長較對照高,GFP表達量也顯著高于對照組(P<0.05)。然而,也有研究發現.大比生長率與.大比生產率并無相關性,高水平的蛋白表達可能導致比生長速率降低。這可以解釋添加0.8%消泡劑C酵母生長速度低于對照,但GFP表達量更高;隨著SLM54474濃度的增加,大腸桿菌的生長速度下降,但酶的效價增加。終上所述,消泡劑是否會對細胞的生長和產物合成產生影響取決于所使用的消泡劑類型和濃度。
消泡劑對細胞的影響
劉躍等研究表明,消泡劑可以通過改變細菌和酵母細胞膜的狀態來改善了目的產物的分泌,或者提高細菌和酵母的生物量來增加目的產物的合成。這與之前的研究結果一致,該研究表明消泡劑可通過擾亂甾醇生物合成來改變膜的滲透性,進而影響酵母細胞的滲透性。甾醇作為酵母質膜的主要成分具有極性羥基的剛性疏水分子,有助于維持膜的結構。膜流動性對于營養攝取和底物交換很重要,并影響膜蛋白和插入位點的運動和活性。結合流式細胞術和熒光測定發現消泡劑可以影響保留在酵母胞內和分泌到培養基中GFP的量。.近還顯示,巴斯德畢赤酵母的麥角甾醇生物合成途徑的改變與重組蛋白分泌的增加有關。
有研究表明植物油可以作為碳源被代謝,但沒有關于其他消泡劑被代謝的報道。對于消泡劑提高生物量的機制有待進一步研究,有些生物可能能夠利用消泡劑來增強生長和合成產物的能力。
消泡劑的選擇
應用于發酵過程的消泡劑通常要符合以下4點要求:
1、 必須是強表面活性劑,具有較低的表面張力,能夠在泡膜上浸入及擴展;
2、 分散性較好,對發酵液有一定的親和性,能夠迅速分散于發酵液中,對泡沫起作用;
3、 對菌體生長、目的產物合成及提取無影響或影響較??;
4、 難溶或不溶,且揮發性小,具有持久的消泡和抑泡性能。
發酵行業中消泡劑的篩選過程: 對消泡劑的物理性質進行檢測,包括性狀、在水,醇類,酸堿中的溶解度、濁點等; 選擇合適的方法進行消泡劑的性能測試; 根據性能測試結果進行搖瓶實驗,考察消泡劑對菌體生長及產物合成的影響,同時篩選適宜的消泡劑添加量; 搖瓶和發酵罐的攪拌模式平及溶氧水不同,搖瓶實驗結果往往不能準確預測發酵罐上的情況,因此,需要進行上罐驗證,同時考察消泡劑的添加方式(滅菌前加入、接種前加入、發酵過程流加等); 確定合適的消泡劑,再參考價格,挑選出.經濟的消泡劑。

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